HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS,7.05)

標(biāo)題：HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS,7.05)

產(chǎn)品概述

產(chǎn)品名稱：HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS,7.05)

產(chǎn)品規(guī)格：100mL

產(chǎn)品保存：-20℃，有效期 1 年

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品介紹： 

外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有很多種，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、顯微注射法等，2×HEPES緩沖鹽溶液主要用于磷酸鈣轉(zhuǎn)染，其主要成分為HEPES，HEPES是一種非離子兩性緩沖劑，能有效控制pH值在6.8~8.2范圍，尤其在 pH7.2～7.4具有較好的緩沖能力，終濃度一般為10～50mmol/L，培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到較好的緩沖能力。

HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS)是一種常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染溶液，主要由HEPES、氯化鈉、磷酸鹽等組成，其最適pH值為7.05~7.12，經(jīng)過濾除菌處理；影響磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率的因素主要有沉淀中DNA含量、DNA在細(xì)胞上停留的時(shí)間、休克時(shí)間；2×HeBS要求DNA濃度在10～ 50μg 為宜，Hela、BALB等細(xì)胞沉淀放置16h，CHO、DUKX、BI等細(xì)胞可以通過甘油、DMSO進(jìn)行熱休克處理以提高轉(zhuǎn)染效率。該試劑僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟：（僅供參考） 

1、在轉(zhuǎn)染前24h用蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)生長狀態(tài)良好。

2、在加入DNA之前2~4h，按9ml/10cm培養(yǎng)皿的比例加入完-全培養(yǎng)液，置于37°C 5%CO?，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3、取適量乙醇沉淀的DNA溶解于450μl無菌水中，加入50μl 2.5MCaCl?，并充分混勻，使Ca2?終濃度達(dá)到0.25M。

4、用移液器一邊吹打2×HeBS，一邊逐滴加入配制好的DNA/CaCl?溶液(操作應(yīng)迅速，一般在30~60s)，并劇烈振蕩5s，室溫下靜置20~30min以形成沉淀。

5、取沉淀均勻加入到培養(yǎng)皿細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)使沉淀于培養(yǎng)液充分混勻，置于37C 5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~16h；如果培養(yǎng)細(xì)胞為CHO、DUKX等，可以DMSO或甘油進(jìn)行休克處理，轉(zhuǎn)染效率會(huì)大大增加，即培養(yǎng)4~6h后用2ml含10%甘油或20%DMSO的完-全培養(yǎng)液替換當(dāng)前培養(yǎng)液，室溫下靜置3min，加5ml PBS搖動(dòng)混勻。

6、去除培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入5~10ml完-全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

7、對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染的不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)收集細(xì)胞并檢測，一般時(shí)間多控制在12~60h以內(nèi)。

8、對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后在非選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)18~48h，一般時(shí)間多控制在24~36h，以便外源基因表達(dá)。

9、用胰-蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，更換適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2~4d更換一次選擇培養(yǎng)液，一般10～14d會(huì)出現(xiàn)目的細(xì)胞克隆。

自備材料： 1、胰-蛋白酶消化液、PBS、無菌水、CaCl?溶液、甘油或DMSO、篩選藥物

注意事項(xiàng)：

1、注意無菌操作，盡量避免污染。

2、對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，可以不用乙醇沉淀的DNA。

3、本品易被細(xì)菌污染，可分裝后-20℃C保存，可延長保質(zhì)期。

4、試劑開封后請盡快使用，以防影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)效果。

5、休克處理某些細(xì)胞系會(huì)使轉(zhuǎn)染效率大大提高，但應(yīng)注意甘油暴露過久易導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

6、轉(zhuǎn)染12~24h后，可以加入終濃度為10mmol/L的丁酸鈉溶液，可以提高病毒滴度。

7、該試劑用于轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)檢測其轉(zhuǎn)染效率，好的轉(zhuǎn)染效率應(yīng)介于30~60%之間。

8、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。